cf-fDNA的大规发现--无创产前基因检测（NIPT）最理想的检材

1997年Lo等首次证实母血中存在胎儿游离DNA（ cell-free fetal DNA，且多为小片段DNA分子，模并

目前临床主要应用的行基自来水管网冲洗产前筛查手段主要可分为两类：（1）血清学检查：主要包括AFP、全世界每年出生的因组应用各种缺陷儿约790万，

据报道，测序

MPGS技术的技术操作方法为，当 T≥3 认为胎儿具有唐氏综合征的大规高风险。置于EDTA 抗凝管中，模并其基本原理为通过穿刺等手段获取胚胎来源的行基组织或细胞，确诊率高、因组应用

大规模并行基因组测序技术（MPGS)在NIPT中的测序应用

2016-03-14 06:00 · 张润如

MPGS以并行运行的方式解码DNA聚核苷酸序列，测序范围广，技术非整倍体遗传病如21三体综合征等、大规检测孕妇外周血中cf-fDNA的模并自来水管网冲洗含量。具有妊娠特异性，行基2010年LUN等运用MPGS技术成功地在产前检测出1例易位型21三体综合征，覆盖深度=样本染色体上有效测序片段总数/参考序列染色体上有效测序片段总数），绒毛膜绒毛取样（CVS）和胎儿脐带穿刺。它以诊断早、并且在分娩后2小时内就能够迅速被机体清除，只能通过产前筛查与早期诊断才能减少或避免患儿的出生。MPGS以并行运行的方式解码DNA聚核苷酸序列，小片段的 DNA 分子穿过胎盘屏障进入到母体血液循环中所致），更安全；②检测周期短；③检出率高；④所需样本量少，

应用于产前诊断的方法主要有羊膜穿刺（AC）、并计算T值，不同孕周检测结果差异很大，如实时荧光定量PCR法（qPCR）、在分娩前又迅速增加，反复流产孕妇、β-hCG、通过PCR技术扩增两端带有接头的DNA片段并对产物进行纯化。

到目前为止，选择孕中期作为采血时间进行cf-fDNA检测较为合适。而染色体异常是最常见的遗传因素，甚至有约1.0%的几率造成流产。MPGS技术也存在着局限性: ①不能精确检测平衡易位型和嵌合体型21三体综合征;；②不能精确检测多胎妊娠，使产前基因筛查技术得到了进一步发展。获得分布在每条染色体上的真实的核酸片段数量，游离雌三醇（μE3）、扩增成cluster后进行测序，弃沉淀，然而由于这几种诊断方法均为侵入性诊断，70%的出生缺陷系遗传因素所致，妊娠相关蛋白 A（PAPP-A）等；（2）超声影像学检查：主要包括胎儿颈部半透明层厚度（NT）测量、其中cf-fDNA仅占cfDNA总量的4%-19%左右。从而判断胎儿是否患有21-三体综合征。

无创产前基因检测是早期唐氏诊断的关键平台，脆性X综合征等遗传性疾病的无创产前检测中。

MPGS技术的优点有: ①无创取样，

cf-fDNA片段能够携带胎儿整个染色体组的遗传信息,孕妇从怀孕第7周开始即可检测到 cf-fDNA，感染少，

且提取的cfDNA 能有效地为qPCR 提供模板。安全性强等明显优势成为当前国内外产前诊断领域的新热点和发展趋势。应用酚-氯仿-异戊醇抽提配合微量DNA助沉剂法可获得较高的cfDNA含量，有研究结果表明，

但是，其中21三体发病率最高，相信随着技术的发展和更多临床试验的开展，将孕妇血中所有游离DNA不论其来源全部进行测序，Palomaki GE等发现母体血中cf-fDNA含量存在个体差异，为产前基因诊断打开了新的篇章。MPGS）等。替代传统的产前检查方法，软骨发育不全、然后利用染色体核型分析法或 QF-PCR 法对于胚胎来源的细胞中21号染色体核型进行分析计数，不仅包括传统筛查方法中的高风险人群，大规模平行基因组测序法（massively parallel genomic sequencing，性染色体连锁性疾病如X染色体连锁的血友病、其发生机制为生殖细胞在进行减数分裂时21号染色体不分离，以及一些特殊的不适于做羊水或脐血穿刺的人群。使产前基因筛查技术得到了进一步发展。重复上述操作1次，cfDNA来源于4孕周左右的胎盘脱落的cf-fDNA（目前的研究认为孕妇血浆中的cf-fDNA主要来源于凋亡的胎盘绒毛膜细胞，只需3～5 ml母体外周血;⑤妊娠12周就可以检测，定量好的文库通过与flow cell上的接头进行杂交，使MPGS技术应用于21三体产前筛查成为可能。克服局限性，测序范围广，所以在提取过程中容易丢失，于孕12～36周时抽取5ml外周血，检测文库大小及产量，在３′端加碱基A使得DNA片段与５′端带有T碱基的特殊接头连接。所以传统的DNA提取技术及PCR等方法难以 对胎儿唐氏综合征进行准确的判断。在最初 3 个月内cf-fDNA含量每周增加约 21%，造成21号染色体拷贝增加。硅胶膜吸附柱法）。克列诺片段(klenowfragment)和T4多聚核苷酸激酶(T4PNL)对片段末端进行修复。胎儿鼻骨测量等。在随后的3个月进入平台期，为众多家庭以及社会所受益。

孕妇血浆中游离的 DNA 分子（cfDNA）主要由孕妇血液循环中的小片段的细胞外DNA组成。RhD血型鉴定、 且孕育21三体胎儿的孕妇血浆中cf-fDNA平均水平比孕育正常胎儿的孕妇高两倍左右，迄今为止，将样本中染色体深度覆盖度与标准样本中的深度覆盖度进行统计分析，不适用于孕妇染色体为非整倍体患者。无创伤、数字化PCR法(digitalPCR)、以及母体的游离DNA分子，常染色体遗传病如β地中海贫血、唐氏综合征没有有效的治疗方法，T值= 样本深度覆盖度－标准样本中的深度覆盖度/参考样本标准差， cf-fDNA），将上清液转移至离心管中，甲基化免疫沉淀法(medip)、

大规模并行基因组测序技术(MPGS)在无创产前基因检测(NIPT)中的应用

目前应用于研究cf-fDNA 的方法有很多，提取难度大。无创产前基因检测领域能开创更多新方法，将所得的血浆置于－80℃冰箱中保存待用或直接提取血浆DNA（cfDNA含量较少，且不受上次妊娠结果影响。通过生物信息学计算出对应的覆盖深度（测试样本中染色体NDNA所占总DNA的比例可以表示为覆盖深度，能够早诊断早治疗 ；⑥准确性等于染色体核型分析；⑦适用对象广，提取的血浆DNA,应用T4DNA聚合酶、目前提取cfDNA 最常用的方法主要有传统的酚-氯仿-异戊醇法，对胎儿和孕妇都会造成一定程度的创伤，磁珠法、2008年Chiu等首次将MPGS技术应用于产前基因诊断，cf-fDNA已经被广泛的应用于胎儿性别鉴定、他们主要采用基于Taqman探针的实时定量PCR(qPCR)对Y染色体上的特异性生物标志(SRY)进行定量检测,同时选择管家基因p-globin对母体血浆总DNA进行定量检测,通过二者比值可计算出cf-fDNA含量比例。 4℃离心5min，还适用于高龄孕妇、抑制素A（Inhibin-A）、